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2019

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細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法

作者：

細(xì)菌總數(shù)檢驗(yàn)方法

一、國(guó)標(biāo)法：采用標(biāo)準(zhǔn)平皿法對(duì)水樣中細(xì)菌作計(jì)數(shù)，這是一種測(cè)定水中好氧的和兼性厭氧的異養(yǎng)細(xì)菌密度的方法，由于細(xì)菌在水體中能以單獨(dú)個(gè)體、成對(duì)、鏈狀，成簇或成團(tuán)的形式存在，此外沒(méi)有單獨(dú)的一種培養(yǎng)基或某一環(huán)境條件能滿足一個(gè)水樣中所有細(xì)菌的生理要求，所以由此法所得的菌落數(shù)實(shí)際上要低于被測(cè)水樣中真正存在的活細(xì)菌的數(shù)目。細(xì)期總數(shù)是指1毫升水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃、24小時(shí)培養(yǎng)后所生長(zhǎng)的菌落數(shù)。一般規(guī)定，1毫升自來(lái)水中總菌數(shù)不得超過(guò)100個(gè)。

1.方法和步驟

（1）采集水樣。

（2）吸取10 ml水樣（河水、污水、游泳池水或港灣水等），注入盛有90ml無(wú)菌水或無(wú)菌海水的三角瓶中，混勻成10-1稀釋液，在吸水樣前，水樣應(yīng)徹底攪動(dòng)均勻。

（3）按10倍稀釋法將水樣稀釋成10-2、10-3、10-4。

（4）根據(jù)水樣的潔凈程度，污染嚴(yán)重者選取10-2、10-3、10-4稀釋度；中等的選取10-1、10-2、10-3稀釋度，每個(gè)稀釋液分別注入兩個(gè)培養(yǎng)皿，每皿1ml。稀釋度的選擇是本試驗(yàn)精確度的關(guān)鍵，選擇適宜者，平皿上菌落總數(shù)介于30—300個(gè)之間。

（5）注入徹底融化，然后冷卻到45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，立即旋搖培養(yǎng)血，充分混勻，水平放置至固化。

（6）接種河水的培養(yǎng)皿，倒置于37℃培養(yǎng)24小時(shí)。

2.結(jié)果與分析

    取同一稀釋度的平板培養(yǎng)物，依菌落計(jì)算原則進(jìn)行計(jì)算。

（1）菌落計(jì)算原則

平皿菌落的計(jì)算，可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡檢查，防止遺漏，也可借助于菌落計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。對(duì)長(zhǎng)得相當(dāng)接近，但不相觸的菌落，應(yīng)予以—一計(jì)數(shù)。對(duì)鏈狀菌落，應(yīng)當(dāng)作為一個(gè)菌落來(lái)計(jì)算。平皿中若有較大片狀菌落時(shí)則不宜采用，若片狀菌落少于平皿的一半時(shí)，而另一半中菌落分布又均勻，則可將其菌落數(shù)的2倍作為全皿的數(shù)目。算出同一稀釋度的平均菌數(shù)，供下一步計(jì)算時(shí)用。

（2）計(jì)算方法

①首先選擇平均菌落數(shù)在30～300者進(jìn)行計(jì)算。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)符合此范圍時(shí)，即可用它作為平均值乘其稀釋倍數(shù)。

②若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)都在30—300之間，則應(yīng)按兩者的比值來(lái)決定。若其比例小于2，應(yīng)報(bào)告兩者的平均數(shù)；若大于2，則報(bào)告其中較小的數(shù)字。

③如果所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。

④若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。

⑤如果全部稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30—300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告之。

③菌落計(jì)數(shù)的報(bào)告，菌落在100以內(nèi)時(shí)，按實(shí)有數(shù)報(bào)告；大于100時(shí)，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，以四舍五入方法計(jì)算，為了縮短數(shù)字后面的零數(shù)也可用10的指數(shù)來(lái)表示

3注意事項(xiàng)

（1）試驗(yàn)中所用玻璃器皿，如培養(yǎng)皿，吸管、試管等必須是完全滅菌的，并在滅菌前徹底洗滌干凈，不得殘留有抑菌物質(zhì)。

（2）用作樣品稀釋的液體，每批都要有空白對(duì)照。如果在瓊脂對(duì)照平板上出現(xiàn)幾個(gè)菌落時(shí)，要追加對(duì)照平板，以判定是空白稀釋液，用于傾注平皿的培養(yǎng)基，還是平皿吸管或空氣可能存在的污染。

（3） 檢樣的稀釋液雖可用滅菌鹽水或蒸餾水，但以用磷酸緩沖鹽水特別是0.1％蛋白胨水為合適，因蛋白胨水對(duì)細(xì)菌細(xì)胞有更好的保護(hù)作用，不會(huì)因?yàn)樵谙♂屵^(guò)程中而使食品檢樣中原已受損傷的細(xì)菌細(xì)胞導(dǎo)致死亡。如果對(duì)含鹽量較高的食品(如醬品等)進(jìn)行稀釋，則需采用蒸餾水。

二、快速檢測(cè)新技術(shù)
1.3M測(cè)試片快速分析技術(shù)
①1 3M測(cè)試片快速分析技術(shù)概念
3M測(cè)試片法是一種便捷可再生水化干膜，適用于細(xì)菌和真菌的計(jì)數(shù)。
②結(jié)果判讀
1）測(cè)試片中含有一種紅色指示染劑可使菌落著色，計(jì)算所有紅色菌落(不論其大小和顏色深淺均計(jì)算之)。
2）測(cè)試片菌落數(shù)適宜計(jì)數(shù)范圍是25-250。
3）測(cè)試片面積約為20平方厘米，當(dāng)菌落數(shù)超過(guò)250個(gè)，為了估計(jì)菌落數(shù)，可選擇其中一個(gè)或數(shù)個(gè)有代表性菌落的小方格(1cm2)，計(jì)算平均菌落數(shù)，再乘以20可得到整個(gè)測(cè)試片上的菌落數(shù)。

4）有很多高數(shù)量菌落，使整個(gè)生長(zhǎng)區(qū)變粉色，應(yīng)計(jì)錄為菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)。
5）有時(shí)菌落分布出現(xiàn)不均衡，,這也記錄為菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)。
6）測(cè)試片上的菌落,最先粗略一看是可計(jì)數(shù)的，然而，你密切注意到生長(zhǎng)區(qū)邊緣，能看到高密度的菌落，應(yīng)記錄為菌落太多無(wú)法計(jì)數(shù)。
3 測(cè)試片法特點(diǎn)
1）工作效率的極大提高
2）品質(zhì)穩(wěn)定的快速測(cè)試片克服了傳統(tǒng)的測(cè)試方法存在的由于使用不同批次的培養(yǎng)基，不同的配制條件，不同配制人員而導(dǎo)致的差異性。
2.ATP法
1）熒光法檢測(cè)總菌落數(shù)原理
螢火蟲會(huì)發(fā)光是由于它能合成將化學(xué)物質(zhì)的化學(xué)能轉(zhuǎn)變?yōu)楣饽艿纳锎呋瘎獰晒馑孛?、蟲熒光素(D-luciferin)以及所有細(xì)胞生物都產(chǎn)生的生物能量物質(zhì)—三磷酸腺苷（ATP）。在有氧的條件下，蟲光素酶催化蟲熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)，形成氧化熒光素并發(fā)出熒光。  
3.MTT法
3.1 MTT法檢測(cè)原理
檢測(cè)原理為活體微生物線粒體中含有琥珀酸脫氫酶，能使外源性MTT（噻唑藍(lán)）還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。Formazan結(jié)晶形成的量與活菌數(shù)成正比。用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，可間接反映活菌細(xì)胞數(shù)量。
 4.流式細(xì)胞術(shù)
1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)原理
檢測(cè)原理：細(xì)胞經(jīng)特異熒光素標(biāo)記后，通過(guò)激光照射，產(chǎn)生特異熒光信號(hào)，通過(guò)對(duì)這些熒光信號(hào)的檢測(cè)和定量計(jì)算出菌群總數(shù)。

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